ABSTRACT
Introduction. For over a century, Sporothrix schenckii was considered the sole species responsible for sporotrichosis. In 2007, scientific community confirmed the disease could be caused by various Sporothrix species. These species differed in their virulence factors and their antifungal sensitivity. Objective. This study aims to characterize 42 Colombian clinical isolates of Sporothrix spp. phenotypically and genotypically. Material and methods. Forty-two clinical isolates were characterized using phenotypic methods. It involved various culture media to determine their growth range at different temperatures and to assess the type and distribution of pigment and colony texture. Microscopic morphology was evaluated through microcultures, as well as the conidia diameter, type of sporulation, and morphology. Additionally, the assimilation of carbohydrates was selected as a physiological trait for species identification. Genotyping of 40 isolates was performed through partial amplification of the calmodulin gene, followed by sequence analysis. Results. Molecular studies enabled the identification of 32 isolates of S. schenckii and 8 isolates of S. globosa. The combination of phenotypic and genotypic methods eased these species characterizations and the recognition keys development based on parameters such as growth diameter at 25 and 30 °C, colony texture (membranous or velvety) on potato dextrose agar, and microscopic morphology with predominance of pigmented triangular, elongated oval globose, or subglobose conidia. Conclusions. Confirmation of the phenotypic characteristics and molecular analysis is crucial for identifying Sporothrix species and determining adequate treatment. This study represents the first phenotypical and genotypical characterization of clinical isolates of Sporothrix spp. reported in Colombia.
Introducción. Por más de un siglo se creyó que Sporothrix schenckii era la única especie responsable de la esporotricosis. Sin embargo, en el 2007, se consideró que podría ser causada por diferentes especies de Sporothrix, que difieren en sus factores de virulencia y su sensibilidad a los antifúngicos. Objetivo. Caracterizar fenotípica y genotípicamente 42 aislamientos clínicos colombianos de Sporothrix spp. Materiales y métodos. Se caracterizaron 42 aislamientos clínicos mediante métodos fenotípicos. Se usaron varios medios de cultivo para determinar el rango de crecimiento a diferentes temperaturas, el tipo y la distribución del pigmento, y la textura de las colonias. Se evaluó la morfología microscópica por microcultivos mediante la determinación del diámetro, el tipo de esporulación y la morfología de las conidias. La asimilación de carbohidratos se usó como una característica fisiológica para identificar las especies. La genotipificación de los 40 aislamientos se llevó a cabo mediante la amplificación parcial del gen que codifica para la calmodulina y se confirmó por secuenciación. Resultados. Mediante estudios moleculares, se identificaron 32 aislamientos de S. schenckii y ocho de S. globosa. La combinación de métodos fenotípicos y genotípicos permitió caracterizar las especies y construir claves para su reconocimiento, con base en parámetros como el diámetro de crecimiento a 25 y 30 °C, la textura de las colonias (membranosa, aterciopelada) en agar papa dextrosa y la morfología microscópica con predominio de conidias (triangulares pigmentadas, ovales globosas elongadas, subglobosas). Conclusiones. La caracterización fenotípica y los análisis moleculares son necesarios para identificar las especies de Sporothrix y, de esta forma, elegir el tratamiento indicado. Esta es la primera caracterización fenotípica y genotípica reportada de aislamientos clínicos colombianos de Sporothrix spp.
ABSTRACT
In order to assess the antifungal activity of methanolic extracts from neem tree (Azadirachta indica A. Juss.), several bioassays were conducted following M38-A2 broth microdilution method on 14 isolates of the dermatophytes Trichophytonmentagrophytes, Trichophyton rubrum, Microsporum canis and Epidermophyton floccosum. Neem extracts were obtained through methanol-hexane partitioning of mature green leaves and seed oil. Furthermore, high performance liquid chromatography (HPLC) analyses were carried out to relate the chemical profile with their content of terpenoids, ofwidely known antifungal activity. The antimycotic Terbinafine served as a positive control. Results showed that there was total growth inhibition of the dermatophytes isolates at minimal inhibitory concentrations (MIC) between 50 μg/mL and 200 μg/mL for leaves extract, and between 625 μg/mL and 2500 μg/mL for seed oil extract. The MIC of positive control (Terbinafine) ranged between 0.0019 μg/mL and 0.0313 μg/mL. Both neem leaves and seed oil methanol extracts exhibited different chromatographic profiles by HPLC, which could explain the differences observed in their antifungal activity. This analysis revealed the possible presence of terpenoids in both extracts, which are known to have biological activity. The results of this research are a new report on the therapeutic potential of neem to the control of dermatophytosis.
Se determinó la actividad antifúngica de extractos metanólicos de la especie Azadirachta indica A. Juss. (Meliaceae), conocida comúnmente como neem, empleando el método de microdilución en caldo M38-A2 de referencia para hongos filamentosos y dermatofitos. Se evaluaron 14 aislamientos de los dermatofitos Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum, Microsporum canis y Epidermophyton floccosum. Los extractos de neem fueron obtenidos mediante partición metanol-hexano a partir de aceite de semillas y hojas verdes maduras. Adicionalmente, se analizaron por cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) con el fin de relacionar su perfil químico con el contenido de terpenoides, de conocida actividad antifúngica. Se empleó como control positivo el antimicótico Terbinafina. Los resultados mostraron inhibición total del crecimiento de los aislamientos de dermatofitos a concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) entre 50 μg/mL y 200 μg/mL para el extracto de hojas y entre 625 μg/mL y 2500 μg/mL para el extracto de aceite de semillas. La CMI encontrada para el control positivo (Terbinafina) fluctuó entre 0,0078 μg/mL y 0,0313 μg/mL. Los extractos metanólicos de hojas y aceite de semillas de neem exhibieron diferentes perfiles cromatográficos en CLAR, lo cual podría explicar las diferencias observadas en su actividad antifúngica. Éste análisis químico reveló la posible presencia de compuestos terpenoides en ambos extractos, los cuales se conocen por su actividad biológica. Los resultados de esta investigación son un nuevo aporte sobre el potencial terapéutico del neem para el control de dermatofitosis.
ABSTRACT
Las líneas celulares de neem (Azadirachta indica A. Juss.) cultivadas en suspensión líquida han demostrado producir metabolitos secundarios bioactivos, particularmente triterpenoides. En consecuencia, se han realizado estudios para el control de microorganismos de importancia médica, como los hongos dermatofitos. El objetivo principal de este trabajo fue evaluar a través de un método de referencia in vitro la actividad antifúngica de diferentes extractos de cultivos celulares de neem sobre varios aislamientos de Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum y Epidermophyton floccosum. Se realizó un escalado de cultivos de suspensiones celulares de neem, a partir de los cuales se obtuvo un extracto crudo metanólico. Éste extracto fue fraccionado posteriormente por cromatografía en columna de silica gel. Con los extractos obtenidos se determinó la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI), siguiendo el método de microdilución en caldo M38-2, con cinco aislamientos de T. mentagrophytes, cinco de T. rubrum y tres de E. floccosum. Se usó como control positivo el antimicótico Terbinafina. Los resultados mostraron que el extracto crudo de biomasa celular de neem inhibe el crecimiento hasta en 100 % de T. mentagrophytes, T. rubrum y E. floccosum. Al evaluar las fracciones por separado, se observó que las de menor polaridad exhibieron en general mayor actividad antifúngica (CMI=109 μg/mL) que el extracto crudo per se (CMI=2500 μg/ mL) y las fracciones más polares (CMI=7000 μg/mL). Lo anterior indica que las células de neem cultivadas en suspensión producen compuestos con actividad antifúngica, siendo más bioactivos los presentes en las fracciones de menor polaridad.
Cell lines of neem (Azadirachta indica A. Juss.) grown in liquid suspension have shown to produce bioactive secondary metabolites, particularly triterpenoids. In consequence, its use as a control of medical microorganisms (like dermatophytes) is proposed. The main goal of this study was to assess the antifungal activity of methanolic extracts from neem cultured cell suspensions on several isolates of Trichophyton mentagrophytes (five isolates), Trichophyton rubrum (five isolates) and Epidermophyton floccosum (three isolates). Neem cell suspension cultures were scaled up, from which a raw methanolic extract was obtained. This extract was fractionated by silica gel column chromatography. The raw methanolic extract and its fractions were used in order to determine the Minimal Inhibitory Concentration (MIC) on the dermatophytes isolates by following M38-A2 broth microdilution method. Antimycotic Terbinafine was used as positive control. The results shown that neem raw cellular biomass extract inhibits the growth of T. mentagrophytes, T. rubrum and E. floccosum in at least 100%. In the evaluations of the separated fractions, it was observed that the low polarity fractions had higher antifungal activity (MIC=109 μg/mL) than the raw extract per se (MIC=2500 μg/mL) and the most polar ones (MIC=7000 μg/mL). The latter suggest that neem cells cultured in liquid suspension produces compounds with antifungal activity, being more active those present in the low polarity fractions.